神經元-神經膠質細胞和免疫細胞的細胞共培養步驟如下：

1將hPSC分化為星形膠質細胞

1.按照STEMdiff™星形膠質細胞分化和成熟試劑盒使用說明中概述的胚狀體（EB）或單層方案進行操作。

2.星形膠質細胞成熟階段：星形膠質細胞在STEMdiff™星形膠質細胞成熟培養基中培養至少3周。

3.通過對培養的細胞亞群進行免疫細胞化學分析來驗證星形膠質細胞分化是否成功。按照STEMdiff™星形膠質細胞分化試劑盒使用說明，細胞群應大于70% S100?+、大于60% GFAP+和低于15% ?III-tubulin或雙皮質素（DCX）陽性。

2 將hPSC分化為小膠質細胞

1.按照STEMdiff™造血試劑盒使用說明中概述的方案生成造血祖細胞（HPC）。

2.過流式細胞術評估HPC分化效率。所得細胞群應大于90% CD43+ 和大于20% CD34/CD45共陽性。

3.按照STEMdiff™小膠質細胞分化和成熟試劑盒使用說明的A部分（小膠質細胞分化）中概述的步驟1-8進行操作。

4.通過流式細胞術評估小膠質細胞分化的效率。所得細胞群應超過80%為CD45和CD11b共陽性。

5.可選步驟：在第五部分的共培養之前，可以使用STEMdiff™小膠質細胞成熟試劑盒進一步培養小膠質細胞，但小膠質細胞分化后的額外培養總時間不得超過10天（成熟期和共培養期的總和）。

3將hPSC分化為前腦神經元

1.根據STEMdiff™前腦神經元分化和成熟試劑盒使用說明中概述的胚狀體（EB）或單層方案進行操作。

注：將神經元前體細胞接種到STEMdiff™前腦神經元成熟培養基中（使用說明C部分第1步）時，星形膠質細胞和小膠質細胞共培養的建議密度范圍為1.5 x 104 - 4 x 104細胞/cm2。最佳密度根據實際情況相應調整。

2.前腦神經元成熟階段：神經元在STEMdiff™前腦神經元成熟培養基中培養至少7天。

3.通過對培養的細胞亞群進行免疫細胞化學分析來驗證前腦神經元分化是否成功。所得細胞群?III-tubulin和FOXG1的陽性率應大于90%，星形膠質細胞標志物GFAP的陽性率應低于10%。

4建立前腦神經元-星形膠質細胞共培養

1.按照STEMdiff™星形膠質細胞試劑盒的使用說明的C部分（星形膠質細胞成熟）的步驟1-5從第一部分中分離成熟的星形膠質細胞。

注：將細胞重新懸浮在1 mL STEMdiff™星形膠質細胞成熟培養基中，然后使用臺盼藍和血細胞計數器進行細胞計數。

2.在STEMdiff™星形膠質細胞成熟培養基中稀釋細胞懸浮液，以獲得所需的細胞濃度和體積。

注：星形膠質細胞懸浮液的濃度和體積應自行優化，并取決于所需的星形膠質細胞與神經元的細胞類型比率、使用的培養孔數量以及第三部分第1步中接種的前腦神經元前體的初始細胞密度。推薦進行共培養時星形膠質細胞與前腦神經元的比率為1:1。

3.取出并棄去第三部分中前腦神經元生成的培養基。

4.將步驟2中制備的懸浮星形膠質細胞接種到前腦神經元上，并在STEMdiff™星形膠質細胞成熟培養基中培養過夜。繼續第五部分。

5建立共培養體系

1.在BrainPhys™的使用說明中，按照“分化培養基的制備"（B部分）的說明制備所需體積的BrainPhys™神經元培養基和添加物。

注：所需培養基的量取決于培養板的形式和所需的共培養的周期。

2.將STEMdiff™小膠質細胞添加物2在室溫下解凍或者在2-8°C下過夜。充分混合。

注：如果不立即使用，請分裝并儲存在-20°C下。請勿超過標簽上標明的有效期 (EXP)。另外，該組分可單獨購買。

3.按照以下步驟制備優化的共培養基：

a. 將STEMdiff™小膠質細胞添加物2添加到BrainPhys™神經元培養基和添加物中，直至最終濃度為1X（如每10 mL培養基添加40 µL添加物）。

b. 充分混合。

注：如果不立即使用，培養基存放在2-8°C下最多2周。

4.從第二部分收集小膠質細胞：

a. 將整個細胞懸浮液轉移到15 mL離心管中。為收集盡可能多的細胞，可以使用含有15 mM HEPES的溫熱DMEM/F-12進行清洗。

b . 以 300 x g轉速離心5分鐘。

c . 去除上清液，并將沉淀物重新懸浮在適當體積的共培養基中。

d . 使用臺盼藍和血細胞計數器計數細胞。

5.在新的共培養基中稀釋小膠質細胞懸浮液，以獲得所需的最終細胞濃度和體積。

6.取出并丟棄第四部分中產生的前腦神經元 - 星形膠質細胞共培養物的培養基。

7.將重新懸浮的小膠質細胞接種到共培養的前腦神經元和星形膠質細胞上。

8.將培養板放入37°C、5% CO2培養箱中。通過快速、短暫地前后和左右移動培養板，使細胞分布均勻。

9.每2-3天使用共培養基進行半換液。

注：小膠質細胞是半粘附的，在更換培養基時可能會被移除。在進行半換液之前，將板放入帶有板適配器的吊桶式離心機中，以100 x g的速度離心2分鐘，使細胞沉降。

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