一、細(xì)胞解凍方法：

準(zhǔn)備一個培養(yǎng)培養(yǎng)瓶，使其包含產(chǎn)品說明書中列出的推薦體積的適當(dāng)培養(yǎng)基，并針對溫度和 pH (CO 2 )進行平衡。

在 37°C 或該細(xì)胞系的正常生長溫度下，在水浴中輕輕攪拌解凍小瓶。解凍應(yīng)該很快，大約 2 分鐘或直到冰晶融化。

從水浴中取出小瓶，并通過浸入或噴灑 70% 乙醇來凈化。在層流組織培養(yǎng)罩中遵循嚴(yán)格的無菌條件進行所有進一步操作。

擰下小瓶的頂部并將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含有 9 mL 推薦培養(yǎng)基的無菌離心管中。通過溫和離心（125 × g 10 分鐘）去除冷凍保護劑 (DMSO)。丟棄上清液，將細(xì)胞重懸于 1 或 2 mL 培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到含有生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)培養(yǎng)瓶中，并通過輕輕搖動混合。

24 小時后檢查細(xì)胞培養(yǎng)物，并根據(jù)需要進行繼代培養(yǎng)。

這里需要注意的是：一些細(xì)胞系可能需要幾天時間才能從冷凍保存中恢復(fù)。比如：一些雜瘤細(xì)胞在培養(yǎng)的第一天活力很差，會產(chǎn)生細(xì)胞碎片。解凍后，細(xì)胞將開始恢復(fù)并進入指數(shù)增長。

二、解凍后的細(xì)胞處理：

一些細(xì)胞供貨商為保證成活率，會解凍后進行發(fā)貨運輸。這些培養(yǎng)瓶用細(xì)胞接種，孵育以確保細(xì)胞生長，然后填充培養(yǎng)基以進行運輸。

收到細(xì)胞培養(yǎng)物后，需要目視檢查培養(yǎng)基是否存在微生物污染的宏觀證據(jù)。這包括異常的 pH 值變化（酚紅的黃色或紫色）、渾濁或顆粒。使用低倍率 (100×) 的倒置顯微鏡檢查培養(yǎng)基是否存在微生物污染的證據(jù)以及細(xì)胞的形態(tài)。

如果細(xì)胞貼壁并以單層生長：

• 如果細(xì)胞已經(jīng)貼附并形成單層，可能需要維持細(xì)胞的生長狀態(tài)和健康狀態(tài)，以便繼續(xù)進行下一步實驗或分析。以下是一些建議來維護單層細(xì)胞的生長和健康狀態(tài)：

• 保持培養(yǎng)基的新鮮和適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)：必須經(jīng)常更換液體培養(yǎng)基，以保持適當(dāng)?shù)?/span>pH，滲透壓和營養(yǎng)素含量。常用的方式是定期檢查培養(yǎng)基的酸堿度和滴定度，做好消毒和表面清潔，防止細(xì)菌、真菌、病毒的交叉感染。

• 檢查和調(diào)整環(huán)境參數(shù)：為了維護細(xì)胞的生長狀況，必須保證細(xì)胞在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境因素下培養(yǎng)。推薦將細(xì)胞培養(yǎng)于CO2孵化器中，溫度保持在37攝氏度下。定期檢查溫度、濕度和氣體氧氣濃度，以便使它們符合細(xì)胞類型的要求。

• 定期更換培養(yǎng)基：細(xì)胞每一到兩天將需要更換培養(yǎng)基，以便消除可能產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物、細(xì)胞分泌物和懸浮物。這還可以幫助保持適當(dāng)?shù)?/span>pH和離子濃度，并提供營養(yǎng)物質(zhì)來促進細(xì)胞增殖和擴增。

• 定期找出并處理細(xì)胞培養(yǎng)中的污染：如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)中存在污染的跡象，需要立即找出并處理。建議采取逆向染色方法，比如酚紅染色，而不是道理西的吉姆薩染色，以避免影響細(xì)胞健康和形態(tài)。處理污染將需要使用抗生素、抗真菌藥物等，但必須謹(jǐn)慎使用，以避免對細(xì)胞的毒性和不良影響。

• 監(jiān)測細(xì)胞增殖和活性：對于已經(jīng)貼壁并形成單層的細(xì)胞，可以使用視覺方式或其他方法監(jiān)測細(xì)胞的增殖和活性。例如，可以檢測細(xì)胞形態(tài)、顏色和密度，以了解細(xì)胞數(shù)量和健康狀態(tài)。建議采用背景熄滅的方法來觀察細(xì)胞的數(shù)量和活性，比如MTT、CCK-8等方法。

大多數(shù)細(xì)胞系開始于原代培養(yǎng)物，原代培養(yǎng)物來源于一塊切碎的或酶分散的組織。原代培養(yǎng)物作為幾種細(xì)胞類型的混合物，保留了它們來源組織的特征。

一段時間后，原代培養(yǎng)物將達到匯合狀態(tài)，即由于細(xì)胞擴張而覆蓋培養(yǎng)培養(yǎng)瓶所有可用空間的狀態(tài)。此時，需要將培養(yǎng)物分解（通常使用胰蛋白酶等蛋白水解酶）為單個細(xì)胞并進行傳代培養(yǎng)（分裂、傳代或轉(zhuǎn)移）。在1次傳代之后，培養(yǎng)物通常被稱為細(xì)胞系。隨著隨后的每次傳代培養(yǎng)，細(xì)胞群變得更加均勻，因為生長更快的細(xì)胞占主導(dǎo)地位。也可以通過克隆從培養(yǎng)物中選出具有所需特性的細(xì)胞。

二倍體細(xì)胞系很少會超過幾次群體倍增。它們的復(fù)制能力有限，在 20 到 80 次種群倍增后開始減慢并停止分裂。

有的證據(jù)表明，在細(xì)胞培養(yǎng)中觀察到的一些細(xì)胞衰老可能是由于不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，而不是預(yù)定的復(fù)制衰老。

還有其他數(shù)據(jù)支持某些物種（尤其是人類）的細(xì)胞即使在改良的培養(yǎng)條件下生長也會出現(xiàn)復(fù)制性衰老。這種衰老是由每次細(xì)胞分裂時染色體末端（端粒）的縮短介導(dǎo)的。

相反，連續(xù)（或永生化）細(xì)胞系具有無限的復(fù)制能力。這些細(xì)胞系通過多種方式中的任何一種通過永生化或轉(zhuǎn)化衍生自細(xì)胞系。許多連續(xù)細(xì)胞系來源于腫瘤組織。 集合中的大多數(shù)細(xì)胞系是連續(xù)的，盡管少數(shù)細(xì)胞系是有限的，例如 CCD-1117Sk 人皮膚成纖維細(xì)胞 (  CRL-2465 ) 或 CCD-18Co 人結(jié)腸 (  CRL-1459 )。

 細(xì)胞傳代培養(yǎng)步驟：細(xì)胞的生長方式主要有兩種，即：貼壁生長和懸浮生長。當(dāng)細(xì)胞在單層或懸浮液中生長和分裂時，它們通常遵循由四個階段組成的特征性生長模式：滯后、對數(shù)或指數(shù)、靜止或平穩(wěn)和下降。

l 停滯期——在培養(yǎng)培養(yǎng)瓶接種后，細(xì)胞立即緩慢生長，同時從傳代培養(yǎng)的壓力中恢復(fù)過來。

l 對數(shù)或指數(shù)期——細(xì)胞進入指數(shù)生長期，一直持續(xù)到整個生長表面被占據(jù)或細(xì)胞濃度超過培養(yǎng)基的容量。

l 靜止期——細(xì)胞增殖減慢并停止。

l 衰退期——如果不更換培養(yǎng)基且細(xì)胞數(shù)量不減少，細(xì)胞就會失去活力，數(shù)量也會減少。

l 為確?；盍?、遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定性，細(xì)胞系需要維持在指數(shù)期。這意味著它們需要在進入穩(wěn)定生長期之前、在單層細(xì)胞達到 100% 匯合之前或在懸浮液達到其最大推薦細(xì)胞密度之前定期進行傳代培養(yǎng)。為每個細(xì)胞系生成生長曲線有助于確定細(xì)胞系的生長特征。

傳代數(shù)和群體倍增水平

原代培養(yǎng)物通常以 1:2 的比例傳代（每次傳代時將它們分成兩半）。大多數(shù)連續(xù)細(xì)胞系以更高的速率復(fù)制，并以更高的分流比進行傳代培養(yǎng)。傳代數(shù)通常是細(xì)胞傳代培養(yǎng)到新容器中的次數(shù)。對于二倍體培養(yǎng)，傳代數(shù)大致等于自培養(yǎng)開始以來的群體倍增次數(shù)（或群體倍增水平，PDL）。這不是連續(xù)細(xì)胞系的情況，因為它們以更高的分流比傳代。因此，PDL 未針對連續(xù)細(xì)胞系確定。在大多數(shù)情況下，PDL 是一個估計值，因為它不考慮任何因壞死或細(xì)胞凋亡死亡或接近衰老且不再分裂的細(xì)胞而丟失的細(xì)胞。

PDL = 3.32 (log Xe – log Xb) + S

Xb 是孵育開始時的細(xì)胞數(shù)。

Xe 是孵育時間結(jié)束時的細(xì)胞數(shù)。

S 是起始 PDL。

蘇州阿爾法生物與海星生物深度合作提供以下產(chǎn)品與服務(wù)：

HyCyte™ 干細(xì)胞、原代細(xì)胞、細(xì)胞系、三系誘導(dǎo)培養(yǎng)試劑、專用培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、基因編輯試劑盒、細(xì)胞株現(xiàn)貨、細(xì)胞專用血清等細(xì)胞生物學(xué)試劑。

提供的服務(wù)包括：CRISPR-Cas9細(xì)胞基因編輯、載體構(gòu)建,病毒包裝,分子量標(biāo)準(zhǔn)品，突變基因標(biāo)準(zhǔn)品，融合基因標(biāo)準(zhǔn)品，細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)，細(xì)胞干擾等服務(wù)。